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對于細胞培養(yǎng)的同學(xué)們來說，最不想遇到的就一定是污染，那各種各樣的細胞污染當(dāng)中，例如細菌污染、真菌污染、病毒污染、支原體污染等等，其中支原體污染是這些污染重最難以分辨、去除的污染之一，接下來我們將全方位來對支原體污染的知識點進行總結(jié)歸納。

支原體最早在1898年被發(fā)現(xiàn)，是沒有一類沒有細胞壁、高度多形性、可以穿過0.22μm濾芯的最小原核細胞微生物。支原體大小一般在0.1-0.3μm之間，體型介于細菌和病毒之間，可以在無生命的培養(yǎng)基中自行生長繁殖，不需寄生，一般附著在皿瓶表面，對絕大多數(shù)抗生素有耐藥性。

根據(jù)研究數(shù)據(jù)表明，細胞培養(yǎng)過程中細胞支原體污染的發(fā)生率超過了60%，而且，在細胞陪支原體污染之后，期初是沒有辦法發(fā)現(xiàn)細胞明顯的形態(tài)變化，不會出現(xiàn)明顯的培養(yǎng)基渾濁變色，也不會出現(xiàn)明顯的細胞死亡，等發(fā)現(xiàn)異常的時候，細胞已經(jīng)經(jīng)過多次傳代，甚至分不清是在哪一代保種是出現(xiàn)的污染，導(dǎo)致無法根治，只能從頭再來，所以，支原體污染是目前科研細胞培養(yǎng)中的一大難題。

實驗室中出現(xiàn)的支原體類型絕大多數(shù)都是以下四類：

口腔支原體、精氨酸支原體、豬鼻支原體、萊氏無膽甾支原體。

實驗室中出現(xiàn)的支原體污染途徑主要有以下幾種：

1、細胞間交叉支原體污染；

2、科研人員的口腔皮膚，在科研過程中沒有按要求做好無菌防護，通過口腔呼出的氣液體或皮膚上沾染實驗操作臺導(dǎo)致口腔支原體、發(fā)酵支原體和人型支原體的污染；

3、工作環(huán)境及實驗器材污染，支原體在超凈臺或生物安全柜上存活的時間最多可以持續(xù)5天，這就意味著在五天內(nèi)有污染過的細胞在環(huán)境中進行過操作，就可能會導(dǎo)致其余細胞也出現(xiàn)污染；

4、細胞培養(yǎng)試劑污染，精氨酸支原體以及無膽甾支原體主要來源就是胎牛血清以及新生牛血清，如果是豬源的胰酶，也可能存在豬鼻支原體；

5、滅菌不恰當(dāng)，沒有徹底滅菌，沒有均勻滅菌，存在衛(wèi)生死角等等也會導(dǎo)致支原體污染加劇。

在細胞培養(yǎng)中，我們第一步是需要在以下幾種情況下去重點觀察細胞是否存在支原體污染：

1、細胞生長變慢(原先生長時間2天長滿的細胞，花了4天還沒有長滿);

2、細胞狀態(tài)變差(原先細胞狀態(tài)飽滿圓潤立體，逐漸變瘦變扁);

3、細胞邊界模糊(細胞相互粘連，邊界不清晰無法分辨);

4、細胞形態(tài)異常(細胞形態(tài)出現(xiàn)拉絲鋪展等情況);

5、在上述情況出現(xiàn)的同時，培養(yǎng)基上清液澄澈、換液后細胞狀態(tài)依舊無改變。

但是要確定存在支原體污染，還是需要通過以下幾種方法：

1、微生物培養(yǎng)法：取懷疑存在支原體污染的細胞上清樣，在特殊瓊脂培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在37℃環(huán)境中孵育14天，陽性情況會出現(xiàn)“煎蛋狀”菌落。

2、DNA熒光染色法:支原體中的DNA中主要以A-T為主，可以被Hoechst 33258染色，存在支原體污染的細胞染色后會明顯看到細胞周圍有許多大小相近的熒光小點或絲狀物，即表明存在支原體污染。

3、PCR法：通過擴增支原體16S核糖體RNA基因，可以檢測多種支原體，操作相較更快速、準確性也相對較高。